革蘭陽性菌鑒定卡不僅能觀察到細菌的形態而且還可將所有細菌區分為兩大類：染色反應呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示；染色反應呈紅色（復染顏色）的稱為革蘭氏陰性細菌，用G--表示。細菌對于革蘭氏染色的不同反應，是由于它們細胞壁的成分和結構不同而造成的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要是由肽聚糖形成的網狀結構組成的，在染色過程中，當用乙醇處理時，由于脫水而引起網狀結構中的孔徑變小，通透性降低，使結晶紫-碘復合物被保留在細胞內而不易脫色，因此，呈現藍紫色；革蘭氏陰性細菌的細胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質含量高，當用乙醇處理時，脂類物質溶解，細胞壁的通透性增加，使結晶紫-碘復合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復染液（番紅）的顏色，因此呈現紅色。

　　革蘭陽性菌鑒定卡使用注意事項：

　　（1）KOH溶液與菌落比例應適當，如菌懸液太稀（加菌落太少）可出現假陰性。4%KOH溶液應新鮮配制（即用前當日配制），否則也易出現假陰性。

　　（2）革蘭陽性菌培養物如超過48小時，可能隨著菌齡增加而失去革蘭陽性菌的特性，而使本試驗從陰性變成陽性，即出現假陽性。因此必須使用新鮮培養物。

　　注：如果有些菌革蘭氏染色區分不明顯，建議兩種方法結合使用，保證結果的準確性。

　　制備菌液：加1-2滴自來水于小試管中，用接種環從斜面上挑取2-3環的菌苔于試管中并充分打均，制成濃稠的菌液。

　　加染色液：加5%孔雀綠水溶液2-3滴于小試管中，用接種攪拌使染料與菌液充分混合。

　　加熱：將此試管浸于沸水浴（燒杯）中，加熱15-20min。

　　涂片：用接種環從試管底部挑數環菌液于潔凈的玻片上，并涂成薄膜。

　　固定：將涂片通過微火3次。

　　脫色：用水洗，直至流出的水中無孔雀綠顏色為止。

　　復染：加沙黃水溶液，染2-3min后，頃去染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸干。

　　鏡檢：用油鏡觀察。